区别就是使用的对象不同，都是第三人称复数的代词。

　　他们，指代一群男人们时用他们；或者是一群人，有男有女时也用他们。

　　它们，指代动物，或者是物品时用它们。至于为什么在男女混合的时候仍然用“他们”，是因为中国五千多年的历史上男尊女卑的思想已经根深蒂固的原因。